实验九 细菌的生化鉴定

实验九 细菌的生化鉴定

一、 实验目的

1、了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法；

2、掌握糖发酵试验、淀粉实验、吲哚实验、M.R.及V. P的原理、方法及相应培养基的制备方法。

3、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义；

4、掌握以上实验的用途。

二、实验原理

各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物特性，这种差异就表现得更加明显。不同细菌具有不同的酶系统，故不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，它们对物质的代谢谱和分解产物也就不同，细菌的这种代谢特点可供鉴别细菌之用。用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应，其在菌株的分类鉴定中具有主要意义。

1、糖发酵实验

不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生

的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。发酵后产生的有机酸： 乳酸、醋酸、丙酸等 （溴甲酚紫变色范围pH5.2~6.8, pH<5.2黄色，pH>6.8紫色） ；发酵后产生的气体： 甲烷、氢、二氧化碳等（杜氏小管内有气泡，产气漂浮）。

2、M.R.及V.P实验

很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）-pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色变为红色。VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸经缩合、脱羧后生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。

3、吲哚实验

吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。

4、淀粉水解实验

微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解成小分子物质才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小的化合物，使其能被运输到细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程可以通过观察细菌菌落周围物质的变化来证实。如可以用滴加碘液到菌落周围看是否变蓝色来检查是否产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸会使培养基pH下降，可以在培养基中事先加入中性红试剂，培养基会从淡红色变为深红色。

5、触酶实验

触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故常用此试验来鉴定。

6、三糖铁实验（硫化氢产生实验）

某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。细菌能发酵乳糖和蔗糖产酸或产酸产气（变黄）。

三、实验仪器、材料和用具

1、实验仪器：37℃恒温培养箱。

2、微生物材料：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌种平板各1个。

3、试剂：40％NaOH溶液、乙醚、甲基红试剂、50g/L α－萘酚(95％乙醇溶液)、30%双氧水和1%溴麝香草酚蓝酒精液。

4、用具：接种环、酒精灯、镊子、试管和杜氏小套管

5、培养基及其配方：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖和山梨醇）和三糖铁培养基。

（1）淀粉培养基100ml（分装于四个三角瓶，包扎，121~126℃灭菌20min）：蛋白胨，2g ；可溶性淀粉，0.4g；氯化钠，1g ；琼脂，3~4g；酵母提取物，1g；加单蒸水定容至100ml ，调整pH 为7.2。

（2）糖发酵培养基：100ml（分装于试管，包扎，105℃灭菌20min）：蛋白胨2g; 氯化钠，1g； 葡萄糖， 1g； 加单蒸水定容100ml；pH调整为为7.4。溴甲酚紫溶液（1.6%水溶液）1ml

（3）M.R.及V.P实验培养基（葡萄糖胰蛋白胨水培养基）：100ml（分装于试管，包扎，105℃灭菌20min）：蛋白胨0.5g; K2HPO4 ，0.5g；葡萄糖，0.5g； 加单蒸水定容100ml；pH调整为为7.4。

甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于300ml 95％酒精中，再加入蒸馏水200ml。

（4）吲哚培养基（胰蛋白胨水培养基）：100ml（分装于试管，包扎，105℃灭菌20min）

蛋白胨1g； 氯化钠，0.5g；加单蒸水定容100ml。

（5）三糖铁琼脂培养基（成品）：按培养基配方加。

具体配方（实验报告可以不抄）：蛋白胨 20.0g；牛肉膏 3.0g；乳 糖 10.0g；蔗 糖 10.0g；葡萄糖 1.0g ；硫酸亚铁铵(含6个结晶水) 0.5g；酚 红 0.025g或5g/L溶液5mL；氯化钠5.0g ；硫代硫酸钠0.5g；琼 脂 12.0g；蒸馏水 1000.0mL

除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.4±0.1。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，搅拌均匀，静置10min，加热煮沸至完全溶解。

将上述两溶液混合均匀后，再加入酚红指示剂，混匀，分装试管(12mm×100mm)，每管约2～4mL，高压灭菌105℃ 20min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。

四、实验原理与步骤

1. 糖发酵实验

① 试管标记：取分别装有不同糖类（如葡萄糖、蔗糖和乳糖等）发酵培养液的试管，根据需要培养的细菌做好标记（如大肠埃希菌、产气肠杆菌、普通变形菌等和空白对照）。

② 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，空白对照中不接种，置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h和72h观察结果。

③ 观察记录：培养后各发酵管与空白对照相比，若接种培养液保持原有颜色，其反应

结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。

2. V.P.试验

① 标记试管：取装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，根据需要将培养的细菌做好标记。

② 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接种，置37℃恒温箱中，培养24～48h。

③ 观察记录：取出以上试管，振荡2min。另取2支空试管相应标记菌名，分别加入2ml以上对应管中的培养液，加入50g/L α－萘酚(95％乙醇溶液)1ml，再加入40％NaOH0.4毫升，摇振混合，置37℃恒温箱中保温30min。试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应（长时间无反应，置室温过夜），次日不变者为阴性。若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。

注：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。

3. 甲基红试验（M.R.试验）

取装有葡萄糖蛋白胨水培养液的试管，接种需培养鉴定的细菌，经过夜培养后，加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，

即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。

4. 吲哚试验

① 试管标记：取装有蛋白胨水培养液的试管，根据需要培养的细菌做好标记。

② 接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。

③ 观察记录 ：加入1ml乙醚（作用是萃取出吲哚），震荡，静止片刻使分层，沿管壁再在培养液中慢慢加入10滴吲哚试剂，使试剂浮于培养物表面，形成两层，观察结果：如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。

5、淀粉水解实验

把淀粉平板培养基平均分成3部分，分别接上提供的2种菌，留一区作为对照。置37℃培养箱内培养24h。将平皿取出，打开皿盖，加少量碘液于平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平板。若菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小。

6、触酶实验

取培养好的细菌于玻片上，然后滴加3%的双氧水数滴，观察结果。 若立即出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。若有气泡产生，则说明该细菌具有过氧化氢酶。

注意：3%的双氧水现用现配。

7、三糖铁实验

以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养18~24h，观察结果。该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌(e.coli)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。

五、实验结果与分析