(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109576172 A(43)申请公布日 2019.04.05
(21)申请号 201811375478.7(22)申请日 2018.11.19
(71)申请人 江南大学
地址 214000 江苏省无锡市蠡湖大道1800
号(72)发明人 孙秀兰 纪剑 张怡芸 皮付伟
邱天宇 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权
代理有限公司 23211
代理人 张勇(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)C12N 1/06(2006.01)C12N 13/00(2006.01)G01N 30/06(2006.01)
权利要求书1页 说明书6页 附图2页
C12R 1/19(2006.01)C12R 1/10(2006.01)C12R 1/445(2006.01)
(54)发明名称
一种用于GC-MS检测细菌代谢组学的前处理方法
(57)摘要
本发明公开了一种用于GC-MS检测细菌代谢组学的前处理方法，属于化学分析检测领域。本发明方法包括细菌的培养、细菌菌液的淬灭和胞内代谢物质的提取；其中，采用甲醇和无菌水混合物对菌液样品进行淬灭，采用乙腈、异丙醇和无菌水混合物对胞内代谢物质进行提取，用组织破碎机结合低温超声相反复对细胞进行破碎提取，得到前处理样品，检测得到的物质可达全覆盖、数量最大化；本发明方法能够用于研究或解决细菌产毒机理、耐药性产生及控制等关键科学问题，应用前景广阔。CN 109576172 ACN 109576172 A
权 利 要 求 书
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1.一种用于GC-MS检测细菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，所述方法包括：细菌的培养、细菌菌液的淬灭和胞内代谢物质的提取；所述淬灭的淬灭液为甲醇和无菌水，其中甲醇和无菌水的体积比为3：2～3：1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淬灭方法包括将淬灭液与菌液混合进行淬灭，其中菌液样品与淬灭液的体积比为1：1～1：4。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取的提取液为乙腈、异丙醇和无菌水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，乙腈、异丙醇和无菌水的体积比为(1～3)：(1～3)：(1～2)。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述提取方法包括将提取液与菌体细胞混合后，加入钢珠进行破碎，然后超声提取。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淬灭方法具体包括：将甲醇和无菌水按照体积比例混合得到淬灭液，预冷至-20℃以下使用，然后与菌液混合进行淬灭。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌细胞胞内代谢产物提取方法具体包括：
将菌体细胞与-20℃以下预冷的提取液混合，加入钢珠于离心管中，置于组织破碎机中进行细胞破碎，然后超声提取，吸出钢珠、离心，取上清液，多次重复，合并上清液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括菌液收集、胞内代谢产物干燥和保存。
10.权利要求1-9任一所述方法在细菌产毒机理或耐药性方面中的应用。
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说 明 书
一种用于GC-MS检测细菌代谢组学的前处理方法
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技术领域
[0001]本发明具体涉及一种用于GC-MS检测细菌代谢组学的前处理方法，属于化学分析检测领域。
背景技术
[0002]代谢组学以定性和定量限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分为目标，以系统生物学的观点集中阐释了生物体代谢反映的全部信息，和蛋白组学、转录组学相互补充，与基因组学一起成为研究生命现象的重要手段。[0003]目前，微生物代谢组学正处于发展阶段。由于微生物本身具有系统简单、基因组数据丰富及代谢网络和生理特性了解全面的特点，且其在生物体系中具有举足轻重的作用，微生物代谢组学在微生物研究领域受到了广泛的关注。微生物代谢组学已成功应用于鉴定及诱变育种、微生物代谢工程、微生物降解污染物以及发酵工程等各个方面。[0004]细菌代谢组学是研究细菌产毒机理、耐药性产生及控制等关键科学问题研究中不可或缺的一环，因此有关细菌的代谢组学也正在起步，例如，Peter Belenky等人研究了抗生素如何影响细菌代谢组变化，为其作用机制的了解打下基础，并增强和优化抗生素治疗的方法。但目前细菌代谢组检测方法还未能完全满足该类研究的需求，前处理方法中破碎与提取不充分严重影响了细菌代谢组学产物收集的数量与覆盖率，许多具有重要标志作用的代谢化合物未能成功被检测出来。[0005]因此，发明一种细菌代谢组的高效前处理方法，对于深入研究其生理代谢及相关耐药性、毒性响应机制具有重要意义。发明内容
[0006]针对现有技术存在的上述不足，本发明针对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，对细菌用于GC-MS检测细菌代谢组学的前处理方法进行探究。[0007]淬灭即迅速降低细胞内的代谢酶活性，使代谢反应停止。常用的淬灭方式有骤变温度法和加有机溶剂法。骤变温度指瞬间改变样品温度至-40℃或>80℃，也有使用液氮灭活，其原理也是迅速降低样品温度至-150℃，抑制代谢酶活性，再于0℃解冻后收集菌体。本发明研究发现，淬灭过程会导致泄露即细胞内代谢物的丢失，且泄露的程度与淬灭时间、温度及加入的有机溶剂量等有关，随着缓冲液的加入，淬灭时间减少，离心速度加快，泄漏程度会减轻。因此本方法采用预冷甲醇和菌液迅速混合，立即低温离心的方法降低泄露程度。[0008]代谢产物的提取需要能够最大限度的提取代谢物，无偏向性，不破坏或改变代谢物的物理或化学特性。目前,文献中报道的代谢物提取方法主要有冷甲醇、热乙醇、高氯酸或碱、热甲醇、甲醇-氯仿混合液以及乙腈等。进一步研究表明,在水或甲醇和水混合物中加入酸性乙腈作提取剂，不仅可提高提取率，而且有效抑制了核苷三磷酸降解成核苷和碱基。因此本方法采用了乙腈、异丙醇和无菌水混合，加入提取剂后用钢珠组织破碎和超声相结合的物理方式，提高了代谢产物的提取效果。
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说 明 书
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本发明的第一个目的是提供一种用于GC-MS检测细菌代谢组学的前处理方法，所
述方法包括：细菌的培养、细菌菌液的淬灭和胞内代谢物质的提取；所述淬灭中的淬灭液为甲醇和无菌水；所述提取的提取液为乙腈、异丙醇和无菌水。[0010]在本发明的一种实施例中，所述淬灭液中甲醇和无菌水的体积比为3：2～3：1。[0011]在本发明的一种实施例中，所述淬灭方法包括将淬灭液与菌液混合进行淬灭，菌液样品与淬灭液的体积比为1：1～1：4。[0012]在本发明的一种实施例中，所述提取液中乙腈、异丙醇和无菌水的体积比为(1～3)：(1～3)： (1～2)。
[0013]在本发明的一种实施例中，所述提取方法包括将提取液与菌体细胞混合后，加入钢珠组织进行破碎，然后超声提取。[0014]在本发明的一种实施例中，所述无菌水用高温高压蒸汽灭菌锅121℃，20min灭菌得到。
[0015]在本发明的一种实施例中，所述细菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。[0016]在本发明的一种实施例中，所述淬灭方法具体包括：[0017]将甲醇和无菌水按照3：2～3：1的体积混合得到淬灭液，预冷至-20℃以下使用，然后与菌液混合进行淬灭。
[0018]在本发明的一种实施例中，所述细菌细胞胞内代谢产物提取方法具体包括：[0019]将淬灭过的菌体细胞离心管放于冰上，加入-20℃预冷的提取液；加入钢珠于离心管中，置于组织破碎机中进行细胞破碎，超声提取；用吸铁石吸出钢珠、离心；取上清液，多次重复，合并上清液。
[0020]在本发明的一种实施例中，所述破碎机是在1200～1800rpm，20～40s，3～6cycle条件下进行细胞破碎。
[0021]在本发明的一种实施例中，所述钢珠直径1-3mm。[0022]在本发明的一种实施例中，所述方法还包括菌液收集、胞内代谢产物干燥和保存。[0023]在本发明的一种实施例中，所述细菌培养的方法包括：将单个细菌菌落划线接种在营养琼脂培养基上，37℃条件下培养12～16小时(优选12h)；用无菌接种环挑取平板上的单一菌落接种至营养肉汤液体培养基中，将试管置于30～37℃(优选37℃)恒温摇床80～120r/min (优选120r/min)培养12～16小时(优选12h)从而得到0.4～0.6(优选0.5)麦氏浊度的细菌菌液样品。
[0024]在本发明的一种实施例中，所述细菌菌液的收集方法包括：[0025]1)样品和淬灭液的混合液需快速涡旋5～10s，均质，4℃离心机1000～1200g，3～6min离心后，弃上清；
[0026]2)在同一离心管中，重复上述淬灭和收集步骤1～2次，得到淬灭后的菌体细胞。[0027]在本发明的一种实施例中，所述细菌菌液淬灭后的保存方法包括：将收集的菌体样品离心管用封口膜密封，置于超低温冰箱保存(优选-80℃)。[0028]在本发明的一种实施例中，所述胞内代谢产物干燥的方法包括：等量分装上清液，一份用于分析，一份备份，真空冷冻(优选4℃)浓缩4～6h，彻底干燥，最后样品中不含任何水。
[0029]在本发明的一种实施例中，所述胞内代谢产物保存的方法为：彻底干燥后，取出立
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刻盖盖，离心管用封口膜密封后，写上标签，置于低温冰箱保存(优选-20℃)或立即衍生化。[0030]本发明的第二个目的是将上述方法应用于细菌产毒机理或耐药性方面中。[0031]本发明有益效果：[0032]1、所采用的细菌菌液样品培养方法，确保了样品菌液内细菌均处于对数生长期，活力最佳，代谢状态较好，保证所提代谢产物结果有效。[0033]2、淬灭方法最大程度保留细菌对数生长期时的状态，及胞内物质情况[0034]3、收集过程最大程度的扣除了培养基质的影响，且得到更多的菌体[0035]4、提取方法确保了细菌细胞破碎完全，非靶向提取胞内代谢物质全覆盖、数量最大化，避免遗漏重要的靶向物质。[0036]5、干燥与保存方法可以确保所提代谢物在存储过程中性质、状态不发生改变，且不影响衍生化效果。
附图说明
[0037]图1：4℃营养琼脂培养基储存的大肠杆菌代谢轮廓色谱图；[0038]图2：27℃营养琼脂培养基培养的沙门氏菌代谢轮廓色谱图；[0039]图3：37℃营养琼脂培养基培养的金黄色葡萄球菌代谢轮廓色谱图。
具体实施方式
[0040]为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。[0041]实施例1
[0042]大肠杆菌代谢组分析前处理方法：[0043](1)大肠杆菌液体培养：
[0044]大肠杆菌接种在营养琼脂培养基上，37℃条件下培养12～14小时，4℃储存，用无菌接种环挑取平板上的单一菌落接种至营养肉汤液体培养基中，将试管置于30～37℃恒温摇床 (80～120r/min)培养12～16小时从而得到0.4～0.6麦氏浊度的大肠杆菌菌液样品；[0045](2)冰甲醇-无菌水淬灭液对大肠杆菌细胞淬灭：
[0046]①将菌液试管样品与冰的淬灭液(甲醇和无菌水以3：2体积比例混合，-20℃冰箱保存预冷)置于冰水混合物上；
[0047]②将甲醇-水淬灭液加入到大肠杆菌菌液样品中，离心管储存，样品和淬灭液体积为1：1；
[0048]③将样品和淬灭液的混合液快速涡旋5～10s，均质，4℃离心机1000～1200g，3～6min离心后，弃上清；
[0049]④在同一离心管中，重复②、③步骤，得到淬灭后的菌体细胞，；-80℃冻存备用。[0050](3)大肠杆菌胞内物质提取：
[0051]①将淬灭过的菌体细胞离心管放于冰上，加入0.5mL-20℃预冷的提取液(乙腈：异丙醇：水3:3:2)；
[0052]②加入2～3枚直径1mm的小钢珠于离心管中，将其置于组织破碎机中1200～1800rpm， 20～40s，3～6cycle进行细胞破碎，4℃超声提取10～20min，并重复该步骤1～2
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次；
③用吸铁石吸出钢珠，将离心管放入4℃离心机12000～14000g，离心3～6min；
[0054]④将上清转移至新的1.5mL离心管中，重复上述①～④提取步骤并合并上清液，涡旋，混匀；
[0055]⑤等量分装上清液，一份用于分析，一份备份；[0056]⑥用于分析的样品真空4℃冷冻浓缩4～6h，彻底干燥后，取出立刻盖盖，-20℃贮存或立即衍生化。
[0057]将处理得到样品进行GC-MS检测：[0058]利用美国力可公司(LECO)Pegasus BT气相色谱飞行时间质谱联用仪检测。色谱条件：色谱柱为DB-5MS(Agilent Technologies)熔融石英毛细管色谱柱，规格为30m(length)×0.25m (id)×0.25μm(film)。采用分流进样方式，进样口温度280℃，进样体积为1μl，载气为高纯氦气(纯度99.995％)，流量控制采用恒流模式，流速为1ml/min。升温程序：起始温度为80℃，保留4min，随后以5℃/min升温到300℃，再保留10min，传输线温度300℃；质谱条件：离子源温度230℃，电子轰击能量70eV，扫描质量范围(50–600)amu，扫描速率 10张谱图/s，溶剂延迟时间4min。样品检测得到的色谱、质谱结果如图1所示，代谢产物数量为213个。
[0059]实施例2
[0060]沙门氏菌代谢组分析前处理方法：[0061](1)沙门氏菌液体培养
[0062]沙门氏菌接种在营养琼脂培养基上37℃条件下培养12～18小时，4℃储存，用无菌接种环挑取平板上的单一菌落接种至营养肉汤液体培养基中，将试管置于30～37℃恒温摇床 (80～120r/min)培养12～18小时从而得到0.4～0.6麦氏浊度的沙门氏菌菌液样品。[0063](2)冰甲醇-无菌水淬灭液对沙门氏菌细胞淬灭：
[0064]①将菌液试管样品与冰的淬灭液(甲醇和无菌水以2：1体积比例混合，-20℃冰箱保存预冷)置于冰水混合物上；
[0065]②将甲醇-水淬灭液加入到沙门氏菌液样品中，离心管储存，样品和淬灭液体积为1：2；
[0066]③将样品和淬灭液的混合液快速涡旋5～10s，均质，4℃离心机1000～1200g，3～6min离心后，弃上清；
[0067]④在同一离心管中，重复②、③步骤，得到淬灭；-80℃冻存。[0068](3)沙门氏菌胞内物质提取
[0069]①将淬灭过的菌体细胞离心管放于冰上，加入0.5mL-20℃预冷的提取液(乙腈：异丙醇：水3:2:1)；
[0070]②加入2～3枚直径1mm的小钢珠于离心管中，将其置于组织破碎机中1200～1800rpm， 20～40s，3～6cycle进行细胞破碎，4℃超声提取10～20min，并重复该步骤1～2次；
[0071]③用吸铁石吸出钢珠，将离心管放入4℃离心机12000～14000g，离心3～6min；[0072]④将上清转移至新的1.5mL离心管中，重复上述①～④提取步骤并合并上清液，涡旋，混匀，；
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[0053]
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⑤等量分装上清液，一份用于分析，一份备份；
[0074]⑥用于分析的样品真空4℃冷冻浓缩4～6h，彻底干燥后，取出立刻盖盖，-20℃贮存或立即衍生化。
[0075]参照实施例1中方法进行GC-MS测试，所得色谱、质谱如图2所示，代谢物数量为227 个。
[0076]实施例3
[0077]金黄色葡萄球菌代谢组分析前处理方法[0078](1)金黄色葡萄球菌液体培养
[0079]金黄色葡萄球菌接种在营养琼脂培养基上，37℃条件下培养12～16小时，用无菌接种环挑取平板上的单一菌落接种至营养肉汤液体培养基中，将试管置于30～37℃恒温摇床 (80～120r/min)培养12～16小时从而得到0.4～0.6麦氏浊度的金黄色葡萄球菌菌液样品。[0080](2)冰甲醇-无菌水淬灭液对金黄色葡萄球菌细胞淬灭：[0081]①将菌液试管样品与冰的淬灭液(甲醇和无菌水以3：1体积比例混合，-20℃冰箱保存预冷)置于冰水混合物上；
[0082]②将甲醇-水淬灭液加入到金黄色葡萄球菌液样品中，离心管储存，样品和淬灭液体积为 1：3；
[0083]③将样品和淬灭液的混合液快速涡旋5～10s，均质，4℃离心机1000～1200g，3～6min离心后，弃上清；
[0084]④在同一离心管中，重复②、③步骤，得到淬灭后的菌体细胞，。-80℃冻存。[0085](3)金黄色葡萄球菌胞内物质提取：
[0086]①将淬灭过的菌体细胞离心管放于冰上，加入0.5mL-20℃预冷的提取液(乙腈：异丙醇：水3:3:1)；
[0087]②加入2～3枚直径1mm的小钢珠于离心管中，将其置于组织破碎机中1200～1800rpm， 20～40s，3～6cycle进行细胞破碎，4℃超声提取10～20min，并重复该步骤1～2次；
[0088]③用吸铁石吸出钢珠，将离心管放入4℃离心机12000～14000g，离心3～6min；[0089]④将上清转移至新的1.5mL离心管中，重复上述①～④提取步骤并合并上清液，涡旋，混匀；
[0090]⑤等量分装上清液，一份用于分析，一份备份；[0091]⑥用于分析的样品真空4℃冷冻浓缩4～6h，彻底干燥后，取出立刻盖盖，-20℃贮存或立即衍生化。
[0092]参照实施例1中方法进行GC-MS测试，所得色谱、质谱如图3所示，代谢物数量为186 个。
[0093]实施例4
[0094]沙门氏菌代谢组分析前处理方法：[0095]参照实施例2，将提取液替换为表2中的提取液2、3或4，其他条件不变，其中得到的淬灭后菌体细胞样品参照实施例2中方法进行GC-MS检测，代谢物数量如表2所示。[0096]表2不同提取液制备的样品中代谢物情况
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提取液成分 提取液成分比例 代谢物数量 提取液2 -20℃预冷甲醇和无菌水 2：1 207 提取液3 甲醇和氯仿 2：1 201 提取液4 冷高氯酸 0.25M/mL 202 [0098]实施例5
[0099]沙门氏菌代谢组分析前处理方法：[0100]参照实施例2，将提取时的破碎方法改为液氮研磨，其他条件不变，制备得到样品，进行GC-MS检测，结果代谢物数量为189个。[0101]对照例1
[0102]对不同淬灭方法进行考察：[0103]参照实施例2，将淬灭液替换为表1中的淬灭液2或3，其他条件不变，其中处理后得到的样品中经过GC-MS检测，代谢物情况如表1所示。[0104]表1不同淬灭液制备的样品中代谢物情况
[0105]
淬灭液成分 淬灭液成分体积比 代谢物数量(个) 实施例2 甲醇和无菌水 2：1 227 淬灭液2 甲醇和氯仿 2：1 95 淬灭液3 90℃热乙醇 / 97 [0106]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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说 明 书 附 图
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说 明 书 附 图
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