培养罗非鱼源无乳链球菌 LZ1F 菌株至对数生长期,收集菌体。利用 OMEGA细菌基因组 DNA 提取试剂盒来提取无乳链球菌 DNA:
(1)取不超过 3 mL 的菌液,在室温下,4000×g,离心 10 min;
(2)倒掉上清,在 180 μL TE Buffer 中重新悬浮沉淀。加 20 μL(50 mg/mL)lysozyme solution,30℃孵育 10 min;
(3)温育后的菌液,室温下 5000×g,离心 5 min。弃去上清,加 200 μL Buffer BTL,漩涡振荡重新悬浮沉淀;
(4)(可选择的步骤)为了完全除去尤其是革兰氏阳性菌的细胞壁,加 25~40 mg Glass Power,漩涡振荡 5 min。静置直至其全部沉于管底,移上清于 1.5 mL 离心管中;
(5)加入 25 μL Proteinase K Solution,漩涡振荡混合均匀。55℃水浴孵育直至细胞完全裂解。(通常,细菌裂解不要超过 1 h。若无振荡水浴器,每隔 20~30 min轻轻晃动样品几次。) (6)在样品中加 5 μL RnaseA,上下颠倒几次混匀,室温下孵育 10~30 min;
(7)加 220 μL Buffer BDL,振荡混匀。65℃孵育 10 min;
(8)加 220 μL 无水酒精(室温,96~100%),高速震荡 20 s 以便充分混匀;
(9)将上步所得样品全部收集于纯化柱中(包括可能形成的沉淀),10000×g 离心 1 min 收集 DNA,丢弃外面的收集管和滤出液;
(10)将纯化柱放入新的 2 mL 收集管中,加入 500 μL Buffer HB 洗涤,10000×g 离心 1 min,倒掉滤液,收集管重复使用;
(11)将纯化柱重新放入上述收集管,加入 700 μL 用乙醇稀释过的 DNA Wash Buffer,10000×g 离心 1 min,倒掉滤液,收集管重复使用;
(12)重复步骤 11。
(13)将纯化柱重新放入收集管内,12000×g 离心 2 min,室温放置数分钟,以完全除去乙醇;
(14)将纯化柱放入 1.5 mL 干净的 EP 管内,加入 50-100 μL 事先预热至 65℃的 Elution Buffer,65℃孵育 3~5 min;
(15)10000×g 离心 1 min,洗脱 DNA;
(16)重新加入 50~100 μL Elution Buffer,10000×g 离心 1 min,洗脱 DNA,-20℃保存。
因篇幅问题不能全部显示,请点此查看更多更全内容