以下实验步骤仅供参考：
1样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入 0.\"2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH
2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定
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先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定
A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为： A260×稀释倍数×40 µg/ml。具体计算如下：
RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260=
0.\"21 RNA浓度=
0.\"21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml或 0.\"84 µg/µl
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 µl，剩余RNA总量为： 35 µl × 0.\"84 µg/µl = 29.\"4 µg ②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围 1.\"8到 2.\"1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶
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1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(
12.\"3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分
0.4M MOPS，pH 7.\"0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 µl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3µgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体
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RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
3样品cDNA合成 ①反应体系 序号反应物剂量 1逆转录buffer2μl 2上游引物 0.\"2μl 3下游引物 0.\"2μl 4 dNTP 0.\"1μl
5逆转录酶MMLV 0.\"5μl 6 DEPC水5μl 7 RNA模版2μl 8总体积10μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶
0.\"5μl，37℃水浴60分钟。
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③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为10
，依次稀释至109 、108 、107 、106 、105 、104 ，以备用。 ②反应体系如下： 标准品反应体系 序号反应物剂量 1SYBR Green 1染料10μl 2阳性模板上游引物F 0.\"5μl
3阳性模板下游引物R 0.\"5μl 4 dNTP 0.\"5μl
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5 Taq酶1μl 6阳性模板DNA5μl 7 ddH 2O 32.\"5μl 8总体积50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 管家基因反应体系： 序号反应物剂量
1 SYBR Green 1染料10μl 2内参照上游引物F 0.\"5μl
3内参照下游引物R 0.\"5μl 4 dNTP 0.\"5μl 5 Taq酶1μl 6待测样品cDNA5μl 7 ddH 2O 32.\"5μl
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8总体积50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。
5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的PCR反应。
反应体系： 序号反应物剂量 1 10×PCR缓冲液 2.\"5 ul 2 MgCl 2溶液 1.\"5 ul 3上游引物F 0.\"5 ul 4下游引物R 0.\"5 ul
5 dNTP混合液3 ul 6 Taq聚合酶1 ul 7 cDNA 1 ul 8加水至总体积为25ul
cDNA模板进行 7 / 9
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72ºC延伸5分钟。
②PCR产物与DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×10 ，依次稀释至109 、108 、107 、106 、105 、104
几个浓度梯度。
6待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。 体系配置如下： 序号反应物剂量
1 SYBR Green 1染料10 ul 2上游引物1ul
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3下游引物1ul 4 dNTP1ul 5 Taq聚合酶2ul 6待测样品cDNA 5ul 7 ddH 2O30ul 8总体积50 ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
7实时定量PCR使用引物列表 引物设计软件： Primer Premier 5.\"0，并遵循以下原则：
引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
8电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
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