实验原理
采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。（参看理论部分） 仪器设备
1．电泳玻管 内径0.5 cm，长12 cm
2．小胶管、玻棒 直径0.7—0.8cm，长1.5—2 cm 3．玻璃滴管、吸管、毛细滴管（灌胶用） 4．微量加样器(50u1)（上样用） 5．桑玻氏管或灯泡瓶 6．真空泵 7．滤纸、剪刀
8．电泳槽、青霉素瓶塞(有孔)、竹筒 9．电泳仪(50mA、400V以上) 10．注射器(5m1)和长针头(剥胶用) 11．培养皿 试剂
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1．丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)：一般可用分析纯(或标准纯)的Acr利Bis，无需进一步提纯。但工业用的Acr利Bis必需提纯或重结晶后才能应用。
Acr的重结晶：将Acr溶于50℃氯仿中(70克／升)，趁热过滤，冷却至-20℃结晶，冷却的布氏漏斗过滤收集结晶，用冷氯仿淋洗，将结晶真空干燥。
纯化的Acr水溶液的pH值在4.9～5.2，只要pH变化不大于0.4pH单位,就可使用。必要时可反复重结晶。
Bis重结晶：12克Bis溶于40～50℃丙酮1升中，趁热过滤。凉后置-20℃结晶，过滤或离心收集结晶。用冷丙酮洗涤，真空干燥。
Acr和Bis的贮存：固体Acr和Bis应贮存棕色瓶中，在干燥、低温和暗处保存，并注意避免超声波、γ-辐射和自然光的照射，(因可引起Acr自身聚合而失效)。Acr和Bis贮存液，由于水解生成丙烯酸和NH3而失效，贮存于4℃冰箱可延缓水解，但也只能保存1—2月。
Acr利Bis是神经性毒剂，同时对皮肤有刺激作用。操作时应予以注意防护，大量操作(如纯化)时应在通风柜中进行，并避免吸入尘埃。
2．TEMED-四甲基乙二胺，避免冰箱保存。 3．过硫酸铵(不能潮解，否则不能用)
4．染色液：用0.05N NaOH配制0.1％溴酚兰液 5．洗脱液：7％醋酸
6．其他试剂：见下表贮存液的配制
按表1配制各贮存液置冰箱中贮存，可放1—2月（但过硫酸铵液贮存冰箱不能超过一周）。
表1 贮存液及工作溶液的配制
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贮存液 100ml溶液中的含量 1N HCl 48.Oml pH 工作溶液配制的体积比 分离胶制备： 1份1号，2份2号，1份1 Tris 36.6克 TEMED 0.23ml 8.9 水； 抽气后加入4份3号 凝胶浓度 7％ pH 8.9 浓缩胶制备： 1份4号，2份5号 2 3 4 Acr 28.0克 Bis 0.725克 过硫酸铵 0.14克 1N HCl 48.Oml Tris 5.98克 TEMED 0.46ml Acr 10.0克 Bis 2.5克 蔗糖 40.0克 电泳槽缓冲液： 6.7 抽气后加入4份6号 凝胶浓度 2.5％ pH 6.7 5 6 7 Tris 0.60克 甘氨酸 2.88克 8.3 用时可稀释10倍 500ml可供12根电泳管 实验操作
1．每人取电泳管1支，标好号码，玻棒堵住底部，加1—2滴40％蔗糖于底端。(与橡皮接触部分凝胶不易聚合)。
2．分离胶制备：10人一组。 吸取：1号 2ml 2号 4ml 在桑玻氏管中混匀，用真空泵抽气至无气泡为止。 水 2ml
抽气后加3号8ml，混匀备用（可灌胶12支）。
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3．用玻璃滴管灌胶于电泳管中，高约8cm，然后在距胶面约1cm处，沿玻管壁缓缓加入3-5mm高的水层(注意：不要打乱凝胶液面，切忌加入的水呈滴状坠入！)，垂直静置凝胶让它进行聚合反应。聚合时可见原来加入水层出现的界面逐渐消失(因相互扩散)，继又出现界面时，表明凝胶已经聚合，再静置15分钟使之聚合完全(应在30—60分钟内聚成)。
4．样品液制备： 血清 1-2滴
40%蔗糖 1滴 于一小试管中混匀备用 0.05%溴酚兰 1滴
5．待分离胶成胶后(重新出现界面15分钟)用滤纸条吸干上层覆盖水 6．浓缩胶制备，10人一组。 吸取：4号 1ml 5号 2ml 在桑玻氏管中混匀,真空泵抽至无气泡为止。 6号 4ml
抽气后加3号1ml，混匀备用。
7．用玻璃滴管灌浓缩胶于分离胶上，高约1～1.5cm，然后小心覆盖蒸馏水高约0.5cm，垂置放置，待其成胶。
8．待浓缩胶成胶后，用滤纸条吸干上层覆盖水，拔去底端玻棒塞，用滤纸条吸干蔗糖液，将胶管套在橡皮塞中，并装至电泳槽内，然后倒入下槽电泳缓冲液，并用缓冲液灌满胶管底部的空隙，排净空气(否则影响电流通过)。
9．上样：倒入上槽电泳缓冲液，用电泳缓冲液小心灌满玻管上端以排出空气。然后用微量加样器吸样品液50ul，加在浓缩胶上。
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10．电泳：上槽——负极 下槽——正极
盘状电泳仪器装置示意图
注：下电极槽可设计为夹层，需要时可通入冷水以降温
电流：开始三分钟 1.5mA/管 三分钟后 2.5mA/管
一般情况可维持4毫安/管，电流太大会产热造成升温，使分离失败，(必要时应进
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行有效的冷却，如用冷水冷却或在低温室进行电泳)。
电泳过程中一般要求电流保持稳定。电泳与所用缓冲液和样品有关，一般可根据指示染料的迁移来决定，如指示染料已迁移至凝胶柱的下端附近或已迁至管长达3／4距离时，即可停止电泳。关闭电源。取出玻管。
缓冲液可以再行使用，但上下槽缓冲液不能混合或互换,因下槽中混有催化剂及氯离子。如换作上槽液，将影响电泳结果。
11．凝胶取出(或剥胶)。
电泳毕，取下电泳玻管，用一长针头注射器(针头长约6～8厘米)，吸满蒸馏水为润滑剂，把针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边压入水，一边使针头慢慢呈螺旋式推进，靠水流压力和润滑力将玻管内壁和凝胶分开。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。一般剥胶是从浓缩胶端开始。剥胶时的要点是不要损伤凝胶柱表面。
12．固定和染色：
固定：为了防止凝胶内分离成份扩散需进行固定，将剥出的凝胶柱浸泡在7％乙酸或1．5％三氯醋酸的水溶液中数分钟即可，也可在染色的同时进行固定。
本实验采取0.1％溴酚兰碱性液直接染色，把胶剥至大试管中，加染色液染色5分钟，染色液回收。用洗脱液(7％醋酸)漂洗脱色，去除凝胶中非特异性吸附的染料，让背景呈浅色或无色，以使区带清晰，和便于定量分析(光密度计扫描测定)。
13．观看结果，描出血清电泳区带图谱，确定清蛋白有无异常。 注意事项
① 备好玻管，加蔗糖后，要观察漏不漏，如漏则应换管。
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② 灌胶时，管内应无气泡。胶面覆盖水时，要轻、慢，不能冲动界面。 ③ 灌完胶后，玻管要垂置放置。吸干胶面覆盖水时，滤纸不能触动胶面。 ④ 灌胶及电泳过程均要记时间，作好记录。 ⑤ 剥胶时，要边进针，边推水，以免刺破凝胶。 思考题
1． 圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高?
2． 圆盘电泳的分子筛效应与凝胶过滤的分子筛效应原理上有何不同? 3． 在做圆盘电泳时,每次装柱时需在表面加盖一层水,为什么?
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