黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生

Acta Horticulturae Sinica

2174 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1074；http：//www. ahs. ac. cn

黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生

王 烨，顾兴芳*，张圣平，苗 晗

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

摘 要：以欧亚杂交类型黄瓜（Cucumis sativus L.）65G × 228的F1为材料，对未受精胚珠进行离体培养，通过6因素5水平的正交试验，研究预处理温度、诱导培养基、TDZ、KT和BA浓度对未受精胚珠雌核发育的影响。结果证明TDZ浓度对胚发生频率有极显著影响，是诱导黄瓜离体雌核发育的最主要因素，当其浓度为0.02 mg · L-1时胚状体的诱导率最高。诱导培养基和KT浓度显著影响胚发生率，而预处理温度和BA浓度影响不显著。硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）含量比例均接近1∶1的诱导培养基，较其他比值较大的培养基的胚发生率有显著提高。利用流式细胞仪进行倍性鉴定，再生植株中单倍体率为18.2%。

关键词：黄瓜；未受精胚珠；单倍体；流式细胞仪

中图分类号：S 642.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）11-2174-09

Studies on Haploid Plant Induction via in vitro Unfertilized Ovule Culture of Cucumber

WANG Ye，GU Xing-fang*，ZHANG Sheng-ping，and MIAO Han

（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：The unpollinated ovules of cucumber（Cucumis sativus L.）line 65G × 228 were used to obtain haploid plants via in vitro gynogenesis. With the unfertilized ovules，a regeneration system of cucumber was established by analizing the effects of pretreatment temperature，induction medium，concentration of TDZ，KT and BA on haploid induction. The results indicated that 0.02 mg · L-1 TDZ was better for the initiation of gynogenesis. Induction medium and concentration of KT significantly affected the frequency of embryo induction. Further，the highest embryo regeneration frequency was achieved at IM3 medium supplemented with 0.75 mg · L-1 KT and 2.0 mg · L-1 BA. The embryos could grow root and develop into the complete plant on MS medium. Flow cytometry analysis showed that 18.2% of the regenerated plants were haploid.

Key words：cucumber；unfertilized ovule；haploid；flow cytometry

黄瓜（Cucumis sativus L.）单倍体培养有助于缩短育种年限，提高育种效率。由于单倍体经染色体加倍后获得的双单倍体（DH）不存在等位基因位点的显隐性作用，隐性基因控制的性状能够获得充分体现，因此可极大降低筛选育种材料时的误选概率。此外，利用单倍体技术还能迅速获得个 收稿日期：2015–08–27；修回日期：2015–10–31

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-25）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：guxingfang@caas.cn）

王 烨，顾兴芳，张圣平，苗 晗.

黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生. 园艺学报，2015，42 (11)：2174–2182. 2175

体完全纯合同质的双单倍体群体，为遗传分析、分子标记和数量性状研究提供理想材料。但黄瓜单倍体的自然发生概率极低（Savin et al.，1988），不能满足科研工作需要，因此人工诱导单倍体发生势在必行，而雌核离体培养是目前最有效的途径。

Gémes-Juhúsz等（2002）首次通过雌核发育途径获得黄瓜单倍体植株，但诱导再生频率较低。魏爱民等（2007）研究了栽培方式和栽培季节对黄瓜未受精子房发育的影响。杜胜利（2001）、杜胜利等（2003）通过对黄瓜离体雌核发育过程的研究发现，外植体中的多种酶活性在诱导前期便产生了明显变化，同时细胞学观察显示雌核发育已启动。此外，陈小鹏等（2005）、王璐等（2008）、刁卫平等（2008）、王烨等（2008）、裴晓利（2011）、裴晓利等（2011）和Li等（2013）还对基因型、培养基、预处理等影响黄瓜单倍体发育的诱导条件和技术环节进行了研究和优化。至今，黄瓜单倍体相关研究开展的虽然较多，但再生频率仍然较低，且多以未授粉子房和幼胚为外植体，所采用的材料也主要是华北密刺类型和欧洲温室类型黄瓜的常规种和自交系。目前尚未见到以欧亚杂交类型黄瓜为材料通过未受精胚珠进行雌核发育诱导的研究报道。

针对上述问题，本研究中以欧亚杂交类型黄瓜65G和华北密刺类型黄瓜228的F1为材料，通过未受精胚珠诱导雌核发育，成功获得黄瓜单倍体植株。这不仅奠定了黄瓜单倍体培养的研究基础，拓宽了单倍体育种技术的应用范围，更为杂交选育、分子标记、遗传图谱构建和基因定位提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料的诱导培养与植株再生

采用的试验材料是以欧洲温室类型黄瓜65G为母本、华北密刺类型黄瓜228为父本配制的F1

代，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组提供。试验于2013年8—11月和2014年4—10月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所葫芦科育种室组培实验室进行。

选取开花前1 ~ 2 d的雌花，流水清洗并去除子房表面的刺瘤，先用75%乙醇消毒30 s，而后在6.5%的次氯酸钠溶液中消毒15 min，无菌水反复冲洗4 ~ 5次，最后无菌滤纸吸干表面水分。不对子房进行切割，将完整子房接种在以MS培养基（Murashige & Skoog，1962）为基础添加TDZ的培养基上进行预培养，其中蔗糖30 g · L-1和植物凝胶2.5 g · L-1，pH 5.8。

在添加TDZ的培养基上预培养7 d后，取出完整子房并沿中心线纵切，剥离胚珠和胎座组织接种在含有KT和BA的诱导培养基上，培养条件为（25 ± 2）℃，LD16︰8。所有诱导培养基均添加30 g · L-1蔗糖和2.5 g · L-1植物凝胶，pH为5.6，于高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。用10 cm培养皿分装培养基，Parafilm石蜡膜封口，每皿接种外植体4 ~ 5个。

胚诱导全过程对包括预培养培养基中的TDZ浓度、预处理温度、诱导培养基（包括大量元素、微量元素和有机物成份，配方见表1）、诱导培养基中的KT浓度和BA浓度在内的5个因素（设一，每个处理3列空白作为误差项）进行6因素5水平的L25（56）正交试验，共25个处理（表2）次重复。

胚发生频率（%）= 有胚状体发生的外植体数/外植体总数 × 100。 试验数据采用Excel和SAS软件进行统计分析。

待胚状体分化出子叶和胚根后，转入MS培养基（30 g · L-1蔗糖和2.5 g · L-1植物凝胶，pH 5.8）中继续生长、发育，获得完整的再生植株。

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表1 诱导培养基配方

Table 1 Concentration micro and macro elements including vitamins in medium for embryo induction mg · L-1 成分

Component

培养基 Medium

IM1 IM2 IM3 IM4 IM5

KNO3 750 2 000 600 300 750 CaCl2 · H2O 165 165 165 300 100 MgSO4 · 7H2O 75 75 190 50 300 KH2PO4 170 420 100 150 100 (NH3)2SO4 100 500 500 400 150 MnSO4 10.5 15 10.5 5 20 ZnSO4 8.6 10 8.6 5 15 H3BO3 7.2 7.2 7.2 6 15 KI 0.83 1.5 0.83 1 0.5 FeSO4 · 7H2O 27.8 27.8 27.8 27.8 27.8 Na2EDTA · 2H2O 37.3 37.3 37.3 37.3 37.3 肌醇 Inositol 130 150 130 200 50 维生素B1 Vitamin B1 0.5 1 0.5 0.1 2 维生素B6 Vitamin B6 1 2 1 0.5 4 烟酸 Nicotinic acid 2 5 2 3 0.5 甘氨酸 Glycine 2 5 2 1 5

1.2 再生植株倍性鉴定

染色体计数法：取2 ~ 3 mm的再生植株幼嫩根尖，经卡诺固定液处理过夜后，切取根尖部分用卡宝染液染色，覆上盖玻片，然后用镊子轻轻敲片，以便根尖组织散开，即可在显微镜下观察。选取染色体分散较好的体细胞进行拍照，统计染色体数。

流式细胞仪测定法：取少量新鲜叶片，置于冰浴的培养皿中，加入细胞裂解液，并用解剖刀将材料切碎。将样品提取液通过微孔膜过滤而后离心到测试管中，上样于流式细胞仪测定植株细胞DNA的相对含量。 1.3 再生植株田间性状调查

当果实长度达到正常商品瓜大小时，测量从瓜蒂至瓜顶的长度，测量距离瓜顶约1/3瓜长处的横径。当植株长到25节后，调查主蔓上每一个节位的花性，计算有雌花发生的节位占总节位数的比例，即雌花率。

2 结果与分析

2.1 黄瓜离体胚珠雌核发育的形态学观察及再生植株的获得

完整的黄瓜子房（图1，a）经过7 d的预培养，形态上没有明显变化，但颜色由绿色转为黄色（图1，b）。子房纵切后剥离胚珠接种在添加KT和BA的诱导培养基中，此时的胚珠为球形、乳白色（图1，c）。培养约1周后便可观察到浅绿色胚珠上出现突起（图1，d）。经过约20 d的诱导培养，球形胚发育为心形胚（图1，e）。40 ~ 45 d后即可获得较完整的幼胚（图1，f），并逐步发育出子叶和胚根（图1，g）。

将幼胚转移到MS培养基中继续生长，可形成正常的叶片和根系（图1，h）。再生植株在7 d左右的短期驯化后移植田间（图1，i）。

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图1 黄瓜未受精胚珠离体培养及单倍体植株再生

a：未受精子房的预培养；b：培养7 d后的未受精子房；c：剥离的胚珠；d：胚珠上形成突起，发育为球形胚；e：心形胚；

f：幼胚；g：发育出子叶和胚根的胚；h：单倍体再生植株；i：移植田间。

Fig. 1 The development of unfertilized ovule via in vitro gynogenesis and plant regeneration

a：Pre-culture of unfertilized ovaries；b：The unfertilized ovaries after 7 d pre-culture；

c：The detached ovules；d：The protuberance on ovule developed into a globular embryoid；e：The heart stage of embryo；

f：The immature embryo；g：The embryo with cotyledon and radical；h：The regenerated plant；

i：The regeneration plans were transplanted to the field.

2.2 不同处理因素对黄瓜未受精胚珠诱导胚状体的影响

将胚珠接种于诱导培养基中60 d后，胚的诱导和分化基本完成。此时调查正交试验各组处理有胚状体发生的子房数，统计胚诱导率（表2）。

利用Excel软件对未受精胚珠的胚发生频率数据进行直观分析，TDZ、预处理温度、诱导培养基、KT和BA等5因素的极差（R）分别为16.92、5.82、9.90、10.12和3.26（表2），可以直观地看出5因素对胚发生的诱导效应表现为TDZ > KT > 诱导培养基 > 预处理温度 > BA。根据直观分析结果，可初步选择有利于提高胚发生频率的因素水平搭配为处理6，即首先利用TDZ浓度为0.02 mg · L-1预培养培养基进行初步诱导，同时4 ℃低温预处理，而后将未受精胚珠接种在IM2诱导培养基上，培养基中添加0.75 mg · L-1的KT和2.0 mg · L-1的BA。

通过SAS软件对胚诱导率数据进行方差分析结果表明，TDZ浓度对胚发生率的影响达到极显著水平，是胚状体发生的最主要影响因素；诱导培养基和KT浓度达到显著水平，而预处理温度和

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BA浓度对胚发生影响不显著（表2）。

表2 不同处理因素对黄瓜未受精胚珠诱导胚状体的影响

Table 2 Effect of different medium and plant growth regulators on embryo induction

处理 编号 Code 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 R F

预处理温度/℃

TDZ/

Pretreatment

（mg · L-1）

temperature

0 4 0 15 0 25 0 30 0 35 0.02 4 0.02 15 0.02 25 0.02 30 0.02 35 0.05 4 0.05 15 0.05 25 0.05 30 0.05 35 0.10 4 0.10 15 0.10 25 0.10 30 0.10 35 0.50 4 0.50 15 0.50 25 0.50 30 0.50 35 16.92 5.82

**

12.401 1.585

诱导培养基

KT/

Induction

（mg · L-1）

medium IM1 0 IM2 0.50 IM3 0.75 IM4 1.00 IM5 2.00 IM2 0.75 IM3 1.00 IM4 2.00 IM5 0 IM1 0.50 IM3 2.00 IM4 0 IM5 0.50 IM1 0.75 IM2 1.00 IM4 0.50 IM5 0.75 IM1 1.00 IM2 2.00 IM3 0 IM5 1.00 IM1 2.00 IM2 0 IM3 0.50 IM4 0.75 9.90 10.12

*

4.655 4.489*

接种子房数

BA/

Number of

（mg · L-1）

ovaries

0 120 0.50 122 1.00 123 2.00 118 4.00 128 2.00 116 4.00 122 0 106 0.50 116 1.00 116 0.50 116 1.00 126 2.00 122 4.00 120 0 103 4.00 114 0 128 0.50 129 1.00 124 2.00 116 1.00 122 2.00 120 4.00 120 0 112 0.50 117

3.26 0.498

产生胚的子房数 Number of embryo induced 0 11 20 17 5 41 37 27 19 24 27 17 21 15 21 25 20 12 17 18 21 6 3 13 22

诱导率/% Frequency of embryo induction0.0 9.0 16.3 14.4 3.9 35.3 30.3 25.5 16.4 20.7 23.3 13.5 17.2 12.5 20.4 21.9 15.6 9.3 13.7 15.5 17.2 5.0 2.5 11.6 18.8

注：R为极差。F即F值，表示样本均数差别的显著性。*、** 分别表示达到5%、1%水平显著性差异。

Note：R indicates the difference the maximum and minimum values ofX value. F indicates the significance of the difference between the sample mean. *，** represent significant at the 0.05，0.01 probability levels.

表3 TDZ浓度5水平的邓肯氏新复极差法多重比较 Table 3 Duncan’s multiple range analysis for concentration of TDZ TDZ/（mg · L-1）

诱导率/%

Frequency of embryo induction

0 8.72 cC 0.02 25.64 aA 0.05 17.38 bB 0.10 15.20 bB 0.50 11.02 cBC

注：小写字母表示P < 0.05水平，大写字母表示P < 0.01水平，不同字母代表显著差异。下同。

Note：Small letters and capital letters in the same line mean significant difference at 0.05 and 0.01 level tested by Duncan’s multiple range analysis respectively，significant differences treatments are indicated by different letter. The same below.

2.3 预培养TDZ浓度对胚状体发生的影响

直观分析和方差分析均证明预培养培养基中的TDZ浓度是影响黄瓜雌核发育的最主要因素。

利用邓肯氏新复极差法对TDZ浓度的5个水平进行多重比较（表3），含有0.02 mg · L-1 TDZ的诱导培养基中，胚状体的诱导率较其他浓度有极显著提高，0.05和0.10 mg · LTDZ的诱导效果较其有极显著下降。0.50 mg · L-1 TDZ诱导率最低，与不添加TDZ的处理间无差异。

-1

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2.4 诱导培养基中无机氮形式及含量对胚状体发生的影响

对5个诱导培养基的试验数据进行邓肯氏新复极差法分析（表4），诱导培养基IM3和IM4的胚发生率最高，两个培养基中的硝态氮（NO3）和铵态氮（NH4）的含量分别为600 mg · L

-1-+

表4 培养基成分5水平的邓肯氏新复极差法多重比较

Table 4 Duncan’s multiple range analysis for

induction medium

诱导培养基 诱导率/%

Induction medium Frequency of embryo induction

IM1 9.50 cB IM2 16.18 abA IM3 19.40 aA IM4 18.82 aA IM5 14.06 bAB

表5 TDZ浓度5水平的邓肯氏新复极差法多重比较 Table 5 Duncan’s multiple range analysis for concentration of TDZ KT/（mg · L-1） 0 0.50 0.75 1.00 2.00

诱导率/%

Frequency of embryo induction 9.58 cB 16.08 abA 19.70 aA 18.32 aA 14.28 bAB

∶500 mg · L

-1

和300 mg · L

-1

∶400

mg · L-1，接近1∶1。IM2和IM5中硝态氮和铵态氮的含量比例增大到4∶1和5∶1，IM2的胚发生率较IM3和IM4有降低，但未达显著水平，而IM5则出现了显著降低。IM1中硝态氮和铵态氮比例达到7.5∶1，则诱导率最低。 2.5 诱导培养基KT浓度对胚状体发生的影响

对诱导培养基中KT浓度的试验数据进行邓肯氏新复极差法分析后发现（表5），KT为0.50 mg · L-1、0.75 mg · L-1和1.0 mg · L-1时胚诱导率没有显著变化，但KT浓度升高到2.0 mg · L-1时胚诱导频率反而会显著下降，而KT浓度降低为0 mg · L时则诱导频率会出现极显著下降。

2.6 再生植株倍性鉴定

-1

将幼胚转移到MS培养基上可诱导生根，生根率均达100%。以正常二倍体（2n = 14）黄瓜为对照，对再生植株进行根尖细胞染色体数分析，发现了体细胞含有7条染色体的单倍体植株（图2）。同时以正常黄瓜二倍体植株叶片为对照，利用流式细胞仪进行倍性鉴定，结果发现，二倍体对照的分离峰出现在相对荧光强度约220时（图3，a），由此推断分离峰出现在相对荧光强度为110的为单倍体（图3，b）。获得的236株再生植株中单倍体率为18.2%。

图2 黄瓜单倍体和二倍体植株的根尖细胞染色体倍性鉴定

Fig. 2 The chromosomes in root tip cells of a diploid plant and a haploid plant from 65G × 228

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图3 黄瓜单倍体和二倍体植株DNA含量分布图

a：二倍体；b：单倍体。

Fig. 3 The DNA distribution of a diploid plant and a haploid plant from 65G × 228

a：Diploid；b：Haploid.

2.7 再生植株群体的田间性状调查

对再生植株群体进行田间调查（表6），瓜长和雌花率在两个亲本之间差异显著，F1在瓜长和瓜横径上均介于亲本之间，而花性上与母本同为雌性系。3个性状在再生植株群体中均表现出连续分布和广泛的变异，尤其是雌花率的变异幅度为0 ~ 100.0。瓜横径和雌花率的偏度大于0，表明两个性状的调查数据中大于均值的数据更为分散。瓜横径的峰度也大于0，说明数据分布较标准正态分布更陡峭。

表6 黄瓜65G、228、F1和再生植株群体的瓜长、瓜粗、雌花率的遗传参数

Table 6 Fruit and pistillate flower associated trait of 65G，228 and F1，and genetic parameters of

regeneration plant population

性状 Trait

瓜长/cm

Fruit length 瓜横径/cm Fruit diameter 雌花率/%

Female flower proportion

亲本Parents

F1

再生植株群体 Regeneration plant population

范围 Range 13.8 ~ 39.6 0.7 ~ 5.8 0 ~ 100.0

标准误 Stedv.

5.42 0.84 30.8

偏度 Skewness –0.05 0.11 0.48

峰度 Kurtosis–0.33 1.26 –1.33

65G 228 平均值 Mean19.5 36.5 25.5 27.9 2.6 3.7 2.8 3.7

100.0 24.0 100.0 33.2

3 讨论

3.1 黄瓜胚珠离体培养诱导单倍体发生

目前主要通过未授粉子房培养和辐射花粉授粉诱导黄瓜单倍体的发生，取得了较好结果，但再生频率仍然较低，且在人工诱导过程中易出现由子房壁组织引起的发育障碍。本研究中以胚珠为诱导对象，但在剥离前先对整个子房进行预培养，使胚珠由活体状态缓和过渡到半离体状态，同时利用TDZ诱导雌核离体发育，而后再从子房中剥离胚珠，彻底转为离体培养。可见，先启动雌核发育机制而后进行剥离，是黄瓜未受精胚珠单倍体诱导的关键环节。剥离后的胚珠虽然处于裸露状态，对培养条件也更严格，却可以更直接地接触到培养基中的营养成分和激素，进而获得更高的胚诱导

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频率，因此胚珠离体培养对于黄瓜而言是一种更为高效的单倍体诱导途径。 3.2 培养基是诱导黄瓜胚珠单倍体发生的重要影响因素

本试验中对基本培养基成分进行改良时发现，硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）含量较接近的IM3和IM4诱导培养基中未受精胚珠的胚发生率较高，随着硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）浓度差逐步增大，胚发生率呈现下降趋势，说明无机氮的存在形式、浓度和比例在黄瓜雌核诱导过程中发挥着重要的调节作用，目前尚未见到这一现象的其它研究报道。 3.3 单倍体培养再生植株的自然加倍

以往的研究发现，通过单倍体培养获得的再生植株多是一个由单倍体、二倍体及多倍体构成的混杂群体，且非单倍体率在不同作物以及不同基因型间存在显著差异。Zhang和Takahata（2001）报道了45个大白菜基因型的小孢子再生植物的自然加倍情况，其中95%的基因型自然加倍率超过50%。Chatelet等（1999）在花椰菜的小孢子培养研究中发现27个基因型的自发二倍体率均在55%以上。李金荣等（2011）利用胡萝卜材料80Q54进行游离小孢子培养，再生植株的二倍体率为63.6%，而材料70198则仅有17.5%。染色体自然加倍现象同样也发生在大孢子单倍体诱导研究中，李伟（2012）通过西葫芦未受精子房离体培养获得再生植株，其中二倍体植株占被检测植株的60%。王璐等（2008）针对黄瓜未受精子房开展胚状体诱导，获得的再生植株经细胞流式仪鉴定为二倍体。而本研究中利用黄瓜胚珠进行离体培养，再生植株的单倍体率仅为18.2%。由此可见，植物单倍体培养中广泛存在着染色体自然加倍现象，但其机理仍不明确。Keller和Armstrong（1981）曾提出小孢子胚自然加倍与胚胎发生初始的核内有丝分裂相关，而小麦的游离小孢子培养研究则证明再生植株的自然加倍率与外植体的预处理方式关系密切（Indrianto et al.，1999）。

在下一步研究工作中，将结合胚珠发育的全过程细胞组织学研究和再生植株自交后代性状观察，深入分析再生植株来源和染色体自然加倍现象。

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