酿酒科技２０１６年第６期（总第２６４期）·ＬＩＱＵＯＲ—ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２０１６Ｎｏ．６（Ｔｏ１．２６４） ５７ ＤＯＩ：１０．１３７４６￣．ｎｊｋｊ．２０１５４７４ 优良非酿酒酵母的分离与发酵性能研究 王晓昌 ，李京宁 ，张惠玲 ，刘 亚 ，付丽霞 （１．宁夏大学农学院食品系，宁夏银川７５００００； ２．宁夏食品检测中心，宁夏银川７５００００） 摘要： 非酿酒酵母对葡萄酒的风味有重要影响。本实验利用ＷＬ培养基对宁夏贺兰山东麓采集的葡萄种植园 土样和葡萄果实表面上附着的非酿酒酵母进行了初步的分离鉴定，为酿造出具有宁夏地区独具风格和特色的地域 性酒种提供基础性探索依据。本实验鉴定出：戴尔有孢圆酵母、葡萄汁有孢汉生酵母、异常汉生酵母和东方伊萨酵 母。并且初步对４种非酿酒酵母进行发酵性能研究。结果表明，戴尔有孢圆酵母在耐ＳＯ 、耐酒精度和产酒度实验 中均有良好表现。 关键词： 非酿酒酵母； 同质化； 分离； 发酵Ｉ陛能； 葡萄酒 中图分类号：ＴＳ２６１．１；ＴＳ２６２．６；ＴＳ２６１．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１—９２８６（２０１６）０６—００５７—０４ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｎｏｎ——Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｙｅａｓｔｓ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｈｅｉｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏｃｈａｎｇ ，ＬＩ Ｊｉｎｇｎｉｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉｌｉｎｇ ，ＬＩＵ Ｙａ ａｎｄ ＦＵ Ｌｉｘｉａ （１．Ｄｅｐａ￣ｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ，Ｎｉｎｇｘｉａ ７５００２ １； ２．Ｎｉｎｇｘｉａ Ｆｏｏｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ，Ｎｉｎｇｘｉａ ７５００００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎｏｎ—Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｙｅａｓｔｓ ｈａｖｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｇｒａｐｅ ｗｉｎｅ ｆｌａｖｏｒ．Ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｎｏｎ—Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｙｅａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏ－ ｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｇｒａｐｅｓ ｉｎ ｖｉｎｅｙａｒｄｓ ｉｎ Ｎｉｎｇｘｉａ Ｈｅｌａｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ ｂｙ ＷＬ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｎｉｎｇｘｉａ ｌｏｃａｌ ｗｉｎｅ ｙｅａｓｔ．Ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｎｏｎ－Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｙｅａｓｔｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ，Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏ一 ７１７１ ｕｖａｒｕｍ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ ａｎｄ ｌｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｗａｓ ｅｘｐｌｏｒｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇ— ｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ ＳＯ２ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｌｃｏｈｏｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏ１． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎｏｎ－Ｓａｃｃｋａｒｏｍｙｃｅｓ ｙｅａｓｔｓ；ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ｇｒａｐｅ ｗｉｎｅ 葡萄酒酿造最初采用的是自然发酵技术，自然发酵 使之发挥酵母优势，应用于酿造葡萄酒中的研究成为行 前期会有大量非酿酒酵母参与。与酿酒酵母相比，非酿 业热点。 酒酵母能产生和分泌甘油、高级醇、各种挥发性化合物以 酒的香气、风味等感官特征有很大的作用。 ２００７年，杨莹等㈦用ｗＬ培养基对分离的３４株酵母 ｒＤＮＡＤ１／Ｄ２区序列分析方法 及多种胞外酶，这些物质与葡萄汁相互作用，对提升葡萄 菌进行分类鉴定，并用２６Ｓ 对这些酵母菌进行分子鉴定，依次验证ｗＬ培养基鉴定 但是非酿酒酵母对葡萄酒风味的影响一般是难以预 结果的可靠性。结果表明，大多数菌株经２种方法的分 测的，非酿酒酵母可能会产生不良的气味和口感。近几 类鉴定的结果一致。本实验采用ｗＬ培养基对酵母菌进 十年，许多葡萄酒生产国放弃了传统的自然发酵法，开始 行初步鉴定。利用商用酵母进行纯种发酵。相比较而言，商用酿酒酵 母耐高酒精度、耐高温，具有较强的竞争有限营养物的能 ｌ材料与方法 １．１材料 力，使葡萄酒的风味更有保障，提高生产效率并且使酒的 酿造便于控制，保证安全高效生产 。但由于商用酿酒 酵母的使用，不能很好地体现葡萄酒的复杂性和典型 性。因此，分离出优良的非酿酒酵母，了解其发酵性能， 基金项目：宁夏回族自治区科技支撑项目（４１３—０３９３）。 收稿日期：２０１５—１２—２１；修回目期：２０１６—０３—０１ 采样：宁夏贺兰山东麓葡萄种植园土样、赤霞珠 葡萄。 １．２培养基及试剂 作者简介：王晓昌（１９９０－），男，硕士，研究方向为微生物发酵，Ｅ—ｍａｉｌ：４０８４２０４５６＠ｑｑ．ｃｏｍ。 通讯作者：张惠玲（１９６３一），女，教授，学士，研究方向为食品生物技术，Ｅ－ｍａｉｈｚｈ１５７９２＠１６３．ｔｏｍ。 优先数字出版时间：２０１６－０４—２５；地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／５２．１０５１．ＴＳ．２０１６０４２５．１４４３．０１５．ｈｔｍｌ。 王晓昌，李京宁，张惠玲，刘 亚，付丽霞·优良非酿酒酵母的分离与发酵性能研究 表１ ５类酵母菌在ｗＬ培养基上的分类结果 ５９ ２．２利用ｗＬ培养基鉴定分离纯化后的酵母菌 有孢汉生酵母和异常汉生酵母。 表３不同酒精浓度对起酵时间的影响 ＷＬ培养基是被设计用来监测饮料发酵过程中的微 生物类群的【 。Ｃａｖａｚｚａ等ｐ 研究表明，在葡萄酒自然发 酵过程中出现的大多数典型的酵母菌种都可以用ｗＬ培 养基进行区分，主要基于菌落颜色及菌落形态。本实验 筛选到的５类酵母在ＷＬ培养基上形成的菌落颜色和形 态见表１【９］。 如表ｌ所示，初步鉴定，从葡萄汁中分离出的２０株酵 母菌株中：１—３号、５—１０号、１３—１５号、１９号、２０号为戴 尔有孢圆酵母；４号、ｌ６号为酿酒酵母；１２号为葡萄汁有 孢汉生酵母；ｌｌ号、１８号为异常汉生酵母；１７号为东方伊 萨酵母。 ２．３发酵特性实验 由于本实验重点筛选非酿酒酵母，４号、１６号为酿酒 酵母，故排除。 ２＿３．１耐Ｓ０ 实验 分离出的４种非酿酒酵母（戴尔有孢圆酵母、葡萄汁 有孢汉生酵母、异常汉生酵母和东方伊萨酵母）在不同浓 度ＳＯ：的灭菌葡萄汁中的起始发酵时间见表２。实验结 果表明，葡萄汁有孢汉生酵母和异常汉生酵母耐ＳＯ：能 力较弱，仅可在ＳＯ：浓度为１００ ｍｇ／Ｌ以下的葡萄汁中生 长，在浓度为２００ ｍｇ／Ｌ时便无法生长。戴尔有孢圆酵 母和东方伊萨酵母耐ＳＯ 能力较强，可以在ＳＯ：浓度为 １５０ ｍｇ／Ｌ的葡萄汁中生长，但在浓度为２００ ｍｇ／Ｌ时，４种 非酿酒酵母均无法生长。 表２不同ｓ０ 浓度对起酵时间的影响 ＳＯ２ 酵母起酵时间（ｈ） （ｍｇ／Ｌ） 戴尔有孢圆葡萄汁有孢汉生异常汉生东方伊萨 注：“一”表示未检出 ２－３．２耐酒精度实验 分离出的４种非酿酒酵母（戴尔有孢圆酵母、葡萄 汁有孢汉生酵母、异常汉生酵母和东方伊萨酵母）在不 同浓度酒精度的灭菌葡萄汁中的起始发酵时间见表 ３。实验结果表明，戴尔有孢圆酵母耐酒精能力最强，在 １４．０％ｖｏｌ的酒精度下可以生长；其次是东方伊萨酵母， 可耐受１２．０％ｖｏｌ的酒精度；耐酒精能力最弱的是葡萄汁 注：“一”表示未检出。 ２＿３－３最佳发酵温度 分离出的４种非酿酒酵母（戴尔有孢圆酵母、葡萄汁 有孢汉生酵母、异常汉生酵母和东方伊萨酵母）在不同温 度的灭菌葡萄汁中的起始发酵时间见表４。实验结果表 明，温度越低，起酵时间越慢。在同等温度下各菌株表现 较接近。戴尔有孢圆酵母、葡萄汁有孢汉生酵母和异常 汉生酵母在２０℃左右，发酵能力最强。东方伊萨酵母随 着温度的升高，发酵能力不断上升（本实验温度最高为 ２５℃）。 表４温度对起酵时间的影响 ２＿３．４最佳发酵ｐＨ值 分离出的４种非酿酒酵母（戴尔有孢圆酵母、葡萄汁 有孢汉生酵母、异常汉生酵母和东方伊萨酵母）在不同 ｐＨ值的灭菌葡萄汁中的起始发酵时间见表５。实验结果 表明，４种非酿酒酵母在各个ｐＨ值环境下，起始发酵时 间较为接近，最佳发酵ｐＨ值均在６～７。 表５不同ｐＨ值对起酵时间的影响 酵母起酵时间（ｈ） ｐＨ值 广丽 鬲丽 两 ■ 丽 ５ １６ １７ １８ １６ ６ １２ １３ ｌ３ １１ ７ １２ １３ １３ ｌ１ ８ １８ １９ ２Ｏ １７ ２．３．５产酒能力测定 分离出的４种非酿酒酵母在灭菌葡萄汁中产酒精情 况见表６。实验结果表明，戴尔有孢圆酵母产酒能力最 强，其次是东方伊萨酵母，葡萄汁有孢汉生酵母和异常汉 生酵母产酒能力最弱。 酿酒科技２０１６年第６期（总第２６４期）·ＬＩＱＵＯＲ－ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２０１６Ｎｏ．６（Ｔｏ１．２６４） 表６菌株产酒精情况 菌株 戴尔有孢圆酵母 葡萄汁有孢汉生酵母 异常汉生酵母 东方伊萨酵母 酒精度（％ｖｏ１） 弱。本研究后续将对选出的优良菌株进行发酵产香的 研究。 参考文献： ［１１ 冯作山．］优良葡萄酒酵母的选育及发酵性能研究［Ｄ】．乌鲁木 齐：新疆农业大学，２０００：２７—２９． ３结论 ［２】杨莹，徐艳文，薛军侠，等．ＷＬ营养琼脂对葡萄酒相关酵母的鉴 定效果验证［Ｊ］．微生物学杂志，２００７，５（２７）：７５－７９． ｍｉｅｒｏｂｉｃａ ｄｉ ｍｏｓｔｉ ｅ ｖｉｎｉ［Ｊ］．Ｖｉｇｎｅｖｉｎｉ，１９９２，９：１７—２０． 【４】杨雪峰，苏龙，刘树文．利用ＷＬ营养培养基鉴定葡萄酒中的相 关酵母菌［Ｊ］．中外葡萄与葡萄酒，２００６（４）：４－７． ［５］李筝，韩北忠，陈晶瑜，等．优良酿酒酵母菌的发酵性能研究［Ｊ］． 中国酿造，２００８（９）：ｌ１． 本实验采集宁夏贺兰山东麓葡萄种植园土样和葡 尔有孢圆酵母、葡萄汁有孢汉生酵母、异常汉生酵母和东 方伊萨酵母。其中戴尔有孢圆酵母数量最多，说明采集 的样品中戴尔有孢圆酵母占的比重较大。葡萄酒生产中 最主要的酵母菌——酿酒酵母在浆果表面及自然发酵前 ３】Ｃａｖａｚｚａ Ａ，Ｇｒａｎｄｏ Ｍ Ｓ，Ｚｉｎｉ Ｃ．Ｒｉｌｅｖａｚｉｏｎｅ ｄｅｌｌａ ｌｆｏｒａ 萄，利用ｗＬ培养基从中分离出５种酵母：酿酒酵母、戴 ［期并不普遍存在，只在发酵中后期少量存在，一般其数量 ［６】王会会．烟台干红葡萄酒发酵过程酵母菌群研究［Ｄ］．济南：山 小于ｌ０～１００ ｃｆｕ／ｇｔ 】，在本实验中分离出了酿酒酵母，原 东轻工业学院，２０１１：３１． 因可能是采摘的葡萄放置时间稍久，葡萄表面有破裂，导 致葡萄汁溢出，提前开始自然发酵。 ［７］诸葛健，王正祥．工业微生物实验技术手册［Ｍ】．北京：中国轻 工业出版社．１９９４：５７—６１． ［８］Ｇｒｅｅｎ Ｓ Ｒ．，Ｇｒａｙ Ｐ Ｅ Ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｒｅｗｉｎｇ［Ｊ］．Ｗａｌｌｅｒｓｔｅｉｎ Ｃｏｍｍ， １９５０，１３：３５７—３６６． 本实验主要对４株非酿酒酵母进行发酵性能研究。 通过采用灭菌的葡萄汁做小瓶发酵实验，发现戴尔有孢 圆酵母在耐ＳＯ 、耐酒精度和产酒度实验中均有良好表 现，在最佳发酵温度和最佳发酵ｐＨ值实验中与其他菌株 差异不大。东方伊萨酵母在最佳发酵温度实验中，随着 温度上升，发酵速率也随着上升，本实验中未测到其最佳 发酵温度，其余３种菌株最佳发酵温度均在２０℃左右。 葡萄汁有孢汉生酵母和异常汉生酵母各方面发酵性能较 ［９］程雷．葡萄自然发酵过程中酵母的分离鉴定及优良葡萄酒酵 母筛选【Ｄ］．哈尔滨：东北林业大学，２０１０． ［１０］Ｍａｎｎａｚｚｕ Ｉ，Ｃｌｅｍｅｎｔｉ Ｆ，Ｃｉａｎｉ Ｍ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ ｓｔａｒｔｅｒｓ 【Ｍ］ＨＣｉａｎｉ Ｍ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆＷｉｎｅ Ｙｅａｓｔｓ．Ｋｅｒａｌａ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｉｇｎｐｏｓｔ，２００２：１９－３３． 中国民间酿酒、品酒大师总部落户今世缘 本刊讯：据《糖酒快讯一白酒》报道，２０１６年５月２２日下午，中国酒业协会与江苏今世缘酒业在美酒飘香的千年古镇高沟签订了中国民间酿 酒、品酒大师总部战略合作协议，中国酒业协会理事长王延才，今世缘酒业董事长、党委书记、总经理周素明出席签字仪式。 成立中国民间酿酒、品酒大师总部，旨在弘扬中华传统酒文化，诠释白酒酿造的因缘，普及公众认知，展示酿酒工匠精神，倡导科学、文明、健 康的饮酒方式，向社会传递白酒的正能量，提高中国酒业的美誉度，促进酒与人、酒与社会的和谐，缔结白酒与消费者之间的美好缘分。 近年来，今世缘酒业积极整合文化资源，打好文化品牌，全力创建以高沟酒非遗保护区为核心区的今世缘国家４Ａ级旅游景区，力促产城互 融。中国民间酿酒大师总部、中国民间品酒大师总部，分别落户在景区建设中的高沟酒（今世缘酒）非遗保护区和规划中的中华缘文化主题园。 在５月２３日上午举行的中国民间酿酒大师总部奠基典礼上，王延才说，最近几年，中国酒业进入了调整期，可喜的是，面对严峻的形势，中国 白酒行业的许多企业在地方党委政府支持下，积极迎难而上，在产业结构和产品结构的调整上创新改革，今世缘酒业就是其中的优秀代表。 无论是在文化营销上，还是在两化融合上；无论是在卓越绩效管理上，还是在幸福企业建设上，今世缘酒业都令人耳目一新，走在行业的 前列。 王延才强调，李克强总理在今年的两会报告中提出要改善产品和服务供给，突出抓好“提升消费品品质，促进制造业升级，加快现代服务业 发展”三个方面，鼓励企业开展个性化定制、柔性化生产，培育精益求精的工匠精神，增品种、提品质、创品牌，这个思想对于中国酒业改革具有重 大的指导意义。 培养民间酿酒大师、民间品酒大师，其目的就是要紧紧依靠广大消费者，为消费者更好的服务，把满足消费者高水平的物质、精神需求作为 中国酒业改革的核心目标和核心任务。 周素明表示，中国民间酿酒、品酒大师总部项目是正在建设的今世缘国家４Ａ级旅游景区的重头戏，是企业转型发展的催化剂，也是企业参 与白酒行业协作的好平台。 “共生、合作、包容、感恩”是缘文化的四大特征，感恩是最高境界。今世缘酒业将始终抱着一颗感恩之心，大力弘扬“追求卓越，缘结天下”的 企业精神，全力以赴建设好、运营好这两个项目，促进自身发展，繁荣地方经济，助力行业转型。（江源荐。骆佳龙编辑） 来源：糖酒快讯一白酒２ＯＩ６一Ｏ５—２４