植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导
一、 实验目的；
通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。 二、 实验原理：
根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。 三、实验内容 实验包括以下3部分内容： 实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存 实验1-2、MS培养基的配制与灭菌 实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导
实验1-1 植物组织培养基母液的配制和保存
1、目的要求 学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制做准备。 2、基本原理
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植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。 在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度，按比例稀释。本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的配制。
MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。 3、实验仪器设备和试剂 3.1仪器、用具
分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量筒、移液抢、微波炉等。 3.2试剂
（1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 （2）MS培养基成分：
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①大量元素(母液Ⅰ)：NH4NO3、KNO3、CaCl2.2H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4； ②微量元素(母液Ⅱ)：KI、H3BO3、MnSO4.4H2O、ZnSO4.7H2O、Na2MoO4.2H2O、 CuSO4.5H2O、CoCl2.6H2O； ③铁盐(母液Ⅲ)：FeSO4.7H2O、Na2.EDTA.2H2O； ④有机成分(母液,维生素和氨基酸)：肌醇、盐酸吡哆醇(维生素B6)、烟酸(Vpp)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸；
（3）植物生长调节物质：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。 4、操作步骤
（1） MS大量元素母液的配制
按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，按照表1中的次序分别准确称量后，分别用50ml 烧杯，加入蒸馏水30 ml溶解（可以加热至60℃～70℃，促其溶解）。溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯中事先加入约50ml的蒸馏水，目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶液，混匀，用250mL容量瓶定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
表1 MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量 化合物名称 培养基用量扩大称取量母液体积(mL) 250 1L培养基吸取母液量（mL） 100 母液 倍数 (mg) （mg/L） 1,900 10 3
大量KNO3 4,750
元素 NHNO43 1,650 4,125 9,25 425 1,100 MgSO4·7H2O 370 KH2PO4 70 CaCl2·2H2O 440 （2）微量元素母液的配制
按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物（除去铁盐）扩大100倍（表2），用万分之一天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
表2 MS培养基微量元素母液（100倍）的配制剂量
培养基用量扩大倍称取量母液体（mg/L） 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 4
1L培养基吸取母液量（mL） 母液 化合物名称 数 (mg) 积(mL) 223 86 MnSO4·4H2O 微 ZnSO4·7H2O 量 H3BO3 元 KI 素 Na2MoO4·2H2O 100 62 8.3 2.5 100 10
CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O 0.025 0.025 10ml* 10ml** *、**：因天平均存在误差，为减少误差带来的影响，建议称取0.25g，溶解并定容至10ml容量瓶中，然后移取10ml，加入混合液中。 （3） 铁盐母液的配制
常用的铁盐是FeSO4·7H2O和Na2-EDTA的螯合物，必须单独配成母液。配制时，按照扩大后的用量（表3），分别称取FeSO4·7H2O和Na2-EDTA，分别溶解后，将FeSO4溶液缓缓倒入Na2-EDTA溶液(需加热溶解)，搅拌均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
表3 MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量
培养基用扩大倍称取量母液体量（mg/L） 数 37.3 100 FeSO4·7H2O 27.8 278 (mg) 373 100 10 积(mL) 1L培养基吸取母液量（mL） 母液 化合物名称 Na2-EDTA 铁盐 （4）有机物母液的配制
按照表4 中各成分浓度扩大后的用量，用感量0.0001g天平分别称量各有机物。可以分别溶解定容，分别装入试剂瓶中，也可以混合溶解定容，
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装入同一试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。一般有机物都溶于水，但叶酸（VBc）先用少量稀氨水或1mol/L NaOH溶液溶解；VH（生物素）先用1mol/L NaOH溶液溶解；VA、VD3、VB12应先用95%乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
表4 MS培养基有机物母液（100倍）的配制剂量
1L培养基吸培养基用扩大倍称取量母液体量 母液 有机物名称 取母液量(mg) 积(mL) （mg/L） 数 （mL） 甘氨酸 有 机 物 VB1 VB6 烟酸 肌醇 2.0 0.4 0.5 0.5 100 100 20 4 5 5 1,000 100 10 （5）激素母液的配制
激素母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般是0.1～2mg/ml，根据需要确定配制的浓度。称量激素要用感量为万分之一天平。本实验选用激素2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。
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2，4-D母液的配制方法为：准确称取10mg 2,4-D，称量后先用少量（1-3ml）95%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即得到0.1mg/ml的2,4-D贮备液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 （6）在配制母液时注意事项： ①培养基各试剂应使用分析纯。
②在称量时应防止药品间的污染，药匙、称量纸不能混用，每种试剂使用一把药匙，多出的试剂原则上不能再倒回原试剂瓶。
③母液配制好后，贴上标签，写清母液名称、试剂浓度或扩大倍数、配制日期，并存放在4℃冰箱中。使用前，要进行检查，若发现试剂中有絮状沉淀、或长菌、或铁盐母液的颜色变为棕褐色，都不应再使用。 5、结果记录与分析
（1）记录本小组配制的培养基母液种类、扩大倍数、母液配制体积、母液中各成分的称取量。
（2）仔细观察在配制母液过程中的现象与遇到的问题，如是否产生浑浊或沉淀，并分析出现混浊的原因。 6、思考题
（1）配置大量元素母液、铁盐母液时，应注意些什么？ （2）配置激素母液时，应注意些什么？
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实验1-2 植物组织培养基MS的配制与灭菌
1、目的要求
学习植物组织固体培养基的配制，学习高压灭菌器的使用，为外植体的接种与初代培养做准备。 2、基本原理
在植物组织培养中，固体培养基是最常用的一种培养基类型。由于培养基中含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节物质，因此，培养基也是微生物繁殖的极好场所。所以，必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。
本实验以可用于胡萝卜等植物初代培养的培养基MS+1mg/L2-4D+3%蔗糖+1%琼脂，pH5.8。配制1L为例，学习培养基的配制方法。 3、实验仪器和试剂 （1）仪器、用具
高压灭菌锅，超净工作台、分析天平(0.0001g)、pH计（或pH试纸）、微波炉、手术剪刀、解剖刀、镊子、药匙、玻棒、称量纸、洗瓶、记号笔、烧杯（1000ml）、量杯、量筒(1000ml，100ml，50ml)、耐热皮筋（或棉绳）、100 ml三角瓶（每人按3-4瓶准备）、培养皿（每2人按1套准备）、封口膜、定性滤纸等。
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（2）试剂
① 95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 ② MS培养基各母液、2-4D母液、蔗糖、琼脂。 4、操作步骤
（1）器皿准备 清洗三角瓶、烧杯、量筒、量杯、镊子、手术刀、培养皿、打孔器等，烘干或自然晾干备用。配制的培养基体积（ mL）
母液取用量（mL）＝
（2）计算母液使用量
母液的扩大倍数
根据下面公式量取母液：
培养基配制量（L）*激素使用浓度（mg/L）
激素母液用量（mL）=———————————————————— 激素母液浓度（mg/ml） 配制1000ml 培养基需要加入各母液的量分别为：
大量元素母液：100ml 微量元素母液：10ml 铁盐母液：10ml
有机物母液：10ml 激素母液：10ml （3）配制
称取适量的琼脂（常用量10g/L）置于1000ml大烧杯中，加蒸馏水500ml左右，在微波炉中加热使之溶解，待琼脂完全溶化后，加入蔗糖（常用量30g/L），溶后，加入上述各种母液，最后，加蒸馏水定容到需配培养基的终体积。
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每组配制MS固体培养基1000ml，培养基组成为：MS+1mg/L 2,4-D+3%蔗糖+1%琼脂(pH5.8)。 （4）pH值调节
充分混合，待温度降至50℃～60℃时，用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCl溶液调pH值到5.8，注意用玻璃棒不断搅动。 （5）分装
搅匀培养基并迅速分装在100mL的三角瓶中(温度低于40℃以下琼脂就会凝固)，每瓶25mL-30 mL左右，1000mL培养基可以分装至30～40瓶，迅速盖上封口膜，用封口材料包上瓶口，扎口后，写上标记，注明配制者姓名和配制日期，准备灭菌。注意：分装时不要把培养基弄到管壁上，以免日后污染。 （6）灭菌
培养基内含有丰富的营养物质，有利于细菌和真菌繁殖，所以培养基配好后要及时灭菌，同时将接种用具，如镊子、解剖刀、蒸馏水、培养皿（装有滤纸）等进行灭菌。 使用高压锅灭菌要注意以下几点：
①检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加蒸馏水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。盖上锅盖，上好螺栓后接通电源加热。 ②排放冷空气，关闭放气阀，当灭菌锅盖上的压力表指针移至
0.1Mpa(121℃)，控制压力表稳定在该压力下15分钟，即达到灭菌目的。
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③灭菌后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基，置于水平台子上，在室温下冷却，同时取出灭菌水、培养皿、镊子、解剖刀、滤纸等。
④灭菌后的培养基应在室温下放置2—3天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否灭菌彻底。经检查没有杂菌生长时方可使用。 要求：每人准备培养基3-4瓶。 5、结果记录与分析
（1）仔细记录培养基制备中，各种母液、试剂称量的量。
（2）观察在配制培养基过程中的现象与遇到的问题，并加以解释。 6、思考题
（1）培养基表达式：MS+1mg/L2-4D+2.5%蔗糖+1%琼脂，pH5.8，表达的含义是什么？
实验1-3 胡萝卜愈伤组织的诱导
1、实验目的
（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法； （2）了解接种的无菌操作技术；
（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。 2、实验原理
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植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。 3、实验仪器和试剂
仪器：超净工作台、光照培养下、酒精灯、打火机、橡皮筋、记号笔、脱脂棉1包、8把水果刀、8个1000ml烧杯(装废液用)，8个500ml广口瓶，内装75%酒精及棉球、8个150ml锥形瓶，内装75%酒精100ml，8个250ml试剂瓶，内装HgCI2或次氯酸钠的消毒液。
无菌器材：吸水纸（定性滤纸）、25套直径90mm的培养皿 、8个250ml三角瓶（或烧杯），8瓶500ml无菌水、8把大号镊子、8把解剖刀。 植物材料：直根胡萝卜。
试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞（或次氯酸钠）。 培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.8 4、实验步骤
（1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射
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约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。
（2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段，置于250ml三角瓶或大烧杯中。
（3）双手用肥皂洗净，以70%乙醇棉将手擦试一遍。以下操作全部在无菌条件下进行。
（4）外植体消毒：将胡萝卜片放人已灭菌的250ml三角瓶（或大烧杯）中，先用70％酒精对胡萝卜消毒5min，然后将酒精倒掉，再用0.1%的升汞消毒10min-12min（或用30%的次氯酸钠的消毒液将植物材料淹没浸泡约30分钟）,倒掉消毒液，然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟，洗时不断摇动三角瓶以确保完全除去消毒液。
（5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约1mm的小片。在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。注意：在每一次使用镊子、解剖刀后，都要对其消毒一次。
（6）接种：在酒精灯焰附近处，取下三角瓶的封口膜，用火烧灼瓶口。用无菌镊子夹取胡萝卜薄片并迅速半插入琼脂培养基上，每瓶放4-5片，
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注意将近根尖的一面接触培养基。将培养瓶口在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒，立即用封口膜封好瓶口。
（7）培养：将接种后的三角瓶放到光照培养箱中，在25℃下的黑暗中培养3-4周。
5、结果记录与分析
（1）接种1周-10天后，调查、计算污染率： 污染率(%)=污染的材料数/接种材料数×100%
（2）每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前培养物的形态，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征（愈伤组织的颜色、质地等），4周后调查、计算愈伤组织诱导率： 诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数/接种材料数×100% 6、思考题
（1）分析影响愈伤组织诱导的主要因素。
（2）以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分，胡萝卜其它部分（如茎、叶、花）能否诱导出愈伤组织？
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